Utilisation et précautions du tube à centrifuger d'ultrafiltration
1) Choisissez un tube d’ultrafiltration adapté.Notez que les membranes UF diffèrent par leur niveau de tolérance à divers produits chimiques.Typiquement, les tubes d'ultrafiltration avec un seuil de poids moléculaire de 10 kDa peuvent être sélectionnés avec un seuil de poids moléculaire qui ne doit pas être supérieur à 1/3 du poids moléculaire de la protéine d'intérêt, tel que 35 kDa.Si le poids moléculaire de la protéine d’intérêt est d’environ 10 kd, un tube d’ultrafiltration avec un seuil de poids moléculaire de 3 KD peut être utilisé.
(2) L'ultrafiltration, fraîchement achetée, est sèche, avec de l'eau ultra pure ajoutée avant utilisation et de l'eau complètement passée à travers la membrane, le bain de glace ou le réfrigérateur pré-refroidi pendant quelques minutes.L'eau, c'est-à-dire le liquide protéique, est ensuite évacuée et la quantité ajoutée n'est pas supérieure à la ligne blanche en haut du tube.L'opération est légère et le tube d'ultrafiltration doit être prérefroidi sur de la glace avant d'ajouter la solution protéique.
3) La masse et le centre de gravité devaient atteindre l’équilibre.A noter que la vitesse de rotation et l'accélération ne sont pas très rapides, sous peine d'endommager directement la membrane d'ultrafiltration.L'ultrafiltration centrifuge a été démarrée (centrifugeuse prérefroidie à 4 degrés).Une fois que le régime des différentes centrifugeuses a été converti en g, c'était différent.L'accélération de la centrifugeuse a été réglée au minimum, réduisant ainsi la pression sur la membrane.Attention, veillez à quitter la centrifugeuse une fois qu'elle a atteint sa vitesse de destination, ou si vous avez un problème, vous ne pourrez pas la manipuler pour la première fois.L'orientation de la membrane par rapport au fuseau a été ajustée conformément aux instructions (le boîtier de la centrifugeuse angulaire est la membrane à l'axe perpendiculaire).En pratique, la vitesse de rotation générale est inférieure à celle indiquée dans les instructions, de sorte que la durée de vie du tube à centrifuger peut être prolongée.
3) La masse et le centre de gravité devaient atteindre l'équilibre.A noter que la vitesse de rotation et l'accélération ne sont pas très rapides, sous peine d'endommager directement la membrane d'ultrafiltration.L'ultrafiltration centrifuge a été démarrée (centrifugeuse prérefroidie à 4 degrés).Une fois que le régime des différentes centrifugeuses a été converti en g, c'était différent.L'accélération de la centrifugeuse a été réglée au minimum, réduisant ainsi la pression sur la membrane.Attention, veillez à quitter la centrifugeuse une fois qu'elle a atteint sa vitesse de destination, ou si vous avez un problème, vous ne pourrez pas la manipuler pour la première fois.L'orientation de la membrane par rapport au fuseau a été ajustée conformément aux instructions (le boîtier de la centrifugeuse angulaire est la membrane à l'axe perpendiculaire).En pratique, la vitesse de rotation générale est inférieure à celle indiquée dans les instructions, de sorte que la durée de vie du tube à centrifuger peut être prolongée.
(4) Une fois concentré sur 1 ml restant, prenez 50 ul de solution tampon, ajoutez 10 ul de flux et voyez s'il y a une couleur bleue, pour déterminer s'il manque des protéines dans le tube d'ultrafiltration.Si le tube fuit, versez à nouveau la couche supérieure et faites couler dans un nouveau tube pour démarrer l'ultrafiltration.Pour déterminer précisément si des tubes ont été oubliés, centrifugez pendant 10 minutes avec 5 mg ml de BSA avant l'écoulement, en utilisant de la colle protéique ou un test brut de Bradford, et continuez en ajoutant la solution protéique concentrée restante (qui fonctionne sur la glace et empêche les protéines de chauffer) jusqu'à ce que tout le concentré a été ajouté.Faites attention pendant la centrifugation si une précipitation des protéines se produit, entraînant la fermeture du tube.En cas de précipitation, déterminer si la cause spécifique de la précipitation est une concentration excessive de protéines ou un tampon inapproprié ;Le premier peut être résolu par ultrafiltration simultanée de plusieurs tubes d’ultrafiltration, en diminuant la concentration, et le second en échangeant différentes solutions tampons jusqu’à ce qu’aucune précipitation de la protéine ne se produise.
(4) Une fois concentré sur 1 ml restant, prenez 50 ul de solution tampon, ajoutez 10 ul de flux et voyez s'il y a une couleur bleue, pour déterminer s'il manque des protéines dans le tube d'ultrafiltration.Si le tube fuit, versez à nouveau la couche supérieure et faites couler dans un nouveau tube pour démarrer l'ultrafiltration.Pour déterminer précisément si des tubes ont été oubliés, centrifugez pendant 10 minutes avec 5 mg ml de BSA avant l'écoulement, en utilisant de la colle protéique ou un test brut de Bradford, et continuez en ajoutant la solution protéique concentrée restante (qui fonctionne sur la glace et empêche les protéines de chauffer) jusqu'à ce que tout le concentré a été ajouté.Faites attention pendant la centrifugation si une précipitation des protéines se produit, entraînant la fermeture du tube.En cas de précipitation, déterminer si la cause spécifique de la précipitation est une concentration excessive de protéines ou un tampon inapproprié ;Le premier peut être résolu par ultrafiltration simultanée de plusieurs tubes d’ultrafiltration, en diminuant la concentration, et le second en échangeant différentes solutions tampons jusqu’à ce qu’aucune précipitation de la protéine ne se produise.
(5) Les premières étapes sont utilisées pour concentrer la protéine, et si le tampon doit être changé, ajouter doucement un nouveau tampon (ultrafiltration à travers une membrane d'ultrafiltration de 0,22 um) à environ 1 ml de protéine totale et reconcentrer à environ 1 ml pendant trois fois consécutives, le volume final concentré final dépendant de la concentration en protéines souhaitée, généralement pas plus de 500 ul, mais également jusqu'à 200 ul.Obtenez 1 000 × ou plus à trois reprises, soit essentiellement autant de changement de tampon, calculé par un enrichissement en volume d'au moins 10 × environ à chaque fois.
(5) Les premières étapes sont utilisées pour concentrer la protéine, et si le tampon doit être changé, ajouter doucement un nouveau tampon (ultrafiltration à travers une membrane d'ultrafiltration de 0,22 um) à environ 1 ml de protéine totale et reconcentrer à environ 1 ml pendant trois fois consécutives, le volume final concentré final dépendant de la concentration en protéines souhaitée, généralement pas plus de 500 ul, mais également jusqu'à 200 ul.Obtenez 1 000 × ou plus à trois reprises, soit essentiellement autant de changement de tampon, calculé par un enrichissement en volume d'au moins 10 × environ à chaque fois.
Heure de publication : 09 novembre 2022