RAP, est la réaction en chaîne par polymérase, qui fait référence à l'ajout de dNTP, de Mg2+, de facteurs d'élongation et de facteurs d'amélioration de l'amplification au système sous la catalyse de l'ADN polymérase, en utilisant l'ADN parent comme matrice et des amorces spécifiques comme point de départ de l'extension, Grâce aux étapes de dénaturation, d'hybridation, d'extension, etc., le processus de réplication in vitro de l'ADN du brin fille complémentaire à l'ADN matrice du brin parent peut amplifier rapidement et spécifiquement n'importe quel ADN cible in vitro.
1. PCR à démarrage à chaud
L'heure de début de l'amplification dans la PCR conventionnelle n'est pas de placer la machine PCR dans la machine PCR, puis le programme commence à s'amplifier.Lorsque la configuration du système est terminée, l'amplification commence, ce qui peut provoquer une amplification non spécifique, et la PCR à démarrage à chaud peut résoudre ce problème.
Qu’est-ce que la PCR à démarrage à chaud ?Une fois le système réactionnel préparé, le modificateur enzymatique est libéré à haute température (généralement supérieure à 90 °C) pendant l’étape de chauffage initiale de la réaction ou étape de « démarrage à chaud », afin que l’ADN polymérase soit activée.Le temps et la température d'activation exacts dépendent de la nature de l'ADN polymérase et du modificateur de démarrage à chaud.Cette méthode utilise principalement des modificateurs tels que des anticorps, des ligands d’affinité ou des modificateurs chimiques pour inhiber l’activité de l’ADN polymérase.Étant donné que l'activité de l'ADN polymérase est inhibée à température ambiante, la technologie de démarrage à chaud offre une grande commodité pour préparer plusieurs systèmes de réaction PCR à température ambiante sans sacrifier la spécificité des réactions PCR.
2. RT-PCR
La RT-PCR (Reverse transcription PCR) est une technique expérimentale de transcription inverse de l'ARNm en ADNc et de son utilisation comme modèle pour l'amplification.La procédure expérimentale consiste à extraire d'abord l'ARN total dans les tissus ou les cellules, à utiliser Oligo (dT) comme amorce, à utiliser la transcriptase inverse pour synthétiser l'ADNc, puis à utiliser l'ADNc comme modèle pour l'amplification PCR afin d'obtenir le gène cible ou de détecter l'expression du gène.
3. PCR quantitative fluorescente
PCR quantitative fluorescente (PCR quantitative en temps réel,RT-qPCR) fait référence à la méthode d'ajout de groupes fluorescents au système de réaction PCR, en utilisant l'accumulation de signaux fluorescents pour surveiller l'ensemble du processus PCR en temps réel, et enfin en utilisant la courbe standard pour analyser quantitativement le modèle.Les méthodes qPCR couramment utilisées incluent SYBR Green I et TaqMan.
4. PCR imbriquée
La PCR imbriquée fait référence à l'utilisation de deux ensembles d'amorces PCR pour deux cycles d'amplification PCR, et le produit d'amplification du deuxième tour est le fragment du gène cible.
Si une mésappariement de la première paire d'amorces (amorces externes) provoque l'amplification d'un produit non spécifique, la possibilité que la même région non spécifique soit reconnue par la deuxième paire d'amorces et continue à s'amplifier est très faible, donc le Amplification par la deuxième paire d'amorces, la spécificité de la PCR a été améliorée.L’un des avantages de la réalisation de deux cycles de PCR est qu’elle permet d’amplifier suffisamment de produit à partir d’un ADN de départ limité.
5. PCR d'atterrissage
Touchdown PCR est une méthode permettant d'améliorer la spécificité de la réaction PCR en ajustant les paramètres du cycle PCR.
Dans la PCR touchdown, la température d'hybridation pour les premiers cycles est réglée quelques degrés au-dessus de la température d'hybridation maximale (Tm) des amorces.Une température d'hybridation plus élevée peut réduire efficacement l'amplification non spécifique, mais en même temps, une température d'hybridation plus élevée aggravera la séparation des amorces et des séquences cibles, ce qui entraînera une réduction du rendement de la PCR.Par conséquent, au cours des premiers cycles, la température d’hybridation est généralement réglée pour diminuer de 1 °C par cycle afin d’augmenter le contenu du gène cible dans le système.Lorsque la température de recuit est abaissée jusqu'à la température optimale, la température de recuit est maintenue pour les cycles restants.
6. PCR directe
La PCR directe fait référence à l’amplification de l’ADN cible directement à partir de l’échantillon sans nécessiter d’isolement et de purification des acides nucléiques.
Il existe deux types de PCR directe :
méthode directe : prélever une petite quantité d’échantillon et l’ajouter directement au PCR Master Mix pour l’identification PCR ;
méthode de craquage : après avoir échantillonné l'échantillon, l'ajouter au lysat, lyser pour libérer le génome, prélever une petite quantité de surnageant lysé et l'ajouter au PCR Master Mix, réaliser l'identification PCR.Cette approche simplifie le flux de travail expérimental, réduit le temps de manipulation et évite la perte d'ADN lors des étapes de purification.
7. RAP de l'entreprise publique
L'épissage de gènes par PCR d'extension de chevauchement (SOE PCR) utilise des amorces avec des extrémités complémentaires pour que les produits de PCR forment des chaînes qui se chevauchent, de sorte que dans la réaction d'amplification ultérieure, grâce à l'extension des chaînes qui se chevauchent, différentes sources de Une technique dans laquelle les fragments amplifiés se chevauchent et assemblés.Cette technologie a actuellement deux directions d'application principales : la construction de gènes de fusion ;mutation dirigée vers le site du gène.
8. IPCR
La PCR inverse (IPCR) utilise des amorces complémentaires inverses pour amplifier des fragments d'ADN autres que les deux amorces et amplifie des séquences inconnues des deux côtés d'un fragment d'ADN connu.
L'IPCR a été conçu à l'origine pour déterminer la séquence de régions inconnues adjacentes et est principalement utilisé pour étudier les séquences de promoteurs de gènes ;les réarrangements chromosomiques oncogènes, tels que la fusion, la translocation et la transposition de gènes ;et l'intégration de gènes viraux, sont également couramment utilisés maintenant. Pour la mutagenèse dirigée, copiez un plasmide avec la mutation souhaitée.
9. dPCR
La PCR numérique (dPCR) est une technique de quantification absolue des molécules d'acide nucléique.
Il existe actuellement trois méthodes pour la quantification des molécules d'acide nucléique.La photométrie est basée sur l'absorbance des molécules d'acide nucléique ;La PCR quantitative fluorescente en temps réel (Real Time PCR) est basée sur la valeur Ct, et la valeur Ct fait référence au numéro de cycle correspondant à la valeur de fluorescence qui peut être détectée ;La PCR numérique est la dernière technologie quantitative basée sur la méthode PCR à molécule unique pour compter la quantification des acides nucléiques est une méthode quantitative absolue.
Heure de publication : 13 juin 2023